方法步驟：
1） 前一天轉(zhuǎn)形的培養(yǎng)皿，當(dāng)菌落長(zhǎng)至約0.5 mm 大小時(shí)，將培養(yǎng)皿移至4℃放置1 h。
2） 準(zhǔn)備一張無菌的硝化纖維濾膜，以鉛筆在邊緣標(biāo)上組別。
◆ 請(qǐng)戴手套后再拿取濾膜！
3） 打開培養(yǎng)皿蓋子，以兩支扁平鑷子將濾膜兩邊夾住，輕輕覆蓋在菌落上方，盡可能避免有氣泡產(chǎn)生。
◆ 注意！濾膜覆蓋上去后就不要再移動(dòng)！
4） 等濾膜*濕透后，以針頭在濾膜邊緣戳洞做記號(hào) （至少做三個(gè)記號(hào)）。小心把濾膜掀起，菌落朝上放置在LB/Amp/IPTG plate 上。蓋上蓋子，在37℃培養(yǎng)2~4 h，以誘導(dǎo)啟動(dòng)T5 promoter，表現(xiàn)其下游基因。原培養(yǎng)皿則置回37℃使菌落再長(zhǎng)出。
5） 將培養(yǎng)皿蓋子打開，培養(yǎng)皿移至充滿chloroform 蒸氣的干燥器中，置放30min。
6） 取一個(gè)空petri dish 或適當(dāng)大小容器，加入20 mL lysis buffer。 把已經(jīng)過chloroform 溶菌的濾膜浸入lysis buffer，在室溫震蕩30 min。
7） 將濾膜以PBS 浸洗搖蕩10 min，再更換PBS 繼續(xù)浸洗10 min。
8） 將濾膜浸于明膠NET 溶液中，室溫?fù)u蕩1 h。
9） 濾膜以PBST 浸洗兩次，每次10 min。
10） 一次抗體以明膠NET 溶液適當(dāng)稀釋，再將濾膜浸入，于室溫?fù)u蕩1 h。
11） 濾膜以PBST 浸洗兩次，繼以PBS 浸洗一次，每次10 min。
12） 將濾膜置于二次抗體溶液中 （以明膠NET 稀釋），于室溫?fù)u蕩1 h。
13） 濾膜以PBST 浸洗兩次，繼以PBS 浸洗一次，每次10 min。
14） 以DAB 溶液進(jìn)行呈色反應(yīng)。觀察呈色情形，當(dāng)訊號(hào)可明顯與背景區(qū)別時(shí)，將濾膜以水浸洗數(shù)次，以中止呈色反應(yīng)。
15） 將濾膜置于濾紙或吸水紙上干燥后與原培養(yǎng)皿對(duì)照，標(biāo)出有正反應(yīng)的菌落位置。濾膜以膠膜護(hù)貝，避光貯存。
16） 選取數(shù)個(gè)正反應(yīng)菌落，以劃單一菌落的方式分別接種在LB/Amp plate 上，置37℃培養(yǎng)直至菌落長(zhǎng)出。亦同時(shí)接種于3 mL LB/Amp 培養(yǎng)液，于37℃震蕩培養(yǎng)過夜，以抽取質(zhì)體，進(jìn)行限制酶分析。

www.hengdixidi.com