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平衡法選擇高親和力噬菌體抗體

更新時間:2013-02-28點擊次數:1640

1.多樣化的噬菌體抗體丈庫中制備噬菌體抗體。
2.根據廠家說明,對抗原進行生物素化。
3.選擇前,在1個1.5m1微量離心管中.用2%MPBS 1m1封閉150ul鏈霉親和素磁珠,室溫1小時。用磁性試管架將碰珠吸向一側。棄去緩沖液。
4.用2%MPBS封閉3個1.5m1微量離心管,室溫1小時;而后,棄去封閉緩沖液。以3個不同濃度將士物素化抗原(總共3管)與溶于2%MPDS(終濃度)的1m1噬茼體樣品(大約1012c{u/m1)進行孵育,室溫振蕩l小時。對于*輪選擇,抗原濃度應分別為Kd/l、Kd/10以及Kd/100;此處Kd=針對抗原的野生型抗體親和力。
5.每管加入50u1鏈霉親和素化磁珠并在轉臺上孵育,室溫15分鐘。將試管放入磁架30秒。磁珠將移向磁體。
6.抽吸上清,讓磁珠留在微量離心管一側。是用200u1吸頭套在巴氏吸管上,再接 到真空源上進行。用PBS/Tween洗滌磁珠7次(每次洗滌用lml),接著用MPBS洗滌2次,再用PBS洗滌1次。每隔一次洗滌就將磁珠轉移到1個新的1.5m1試管中,以充分洗滌。
7.用100u1 100mmol/L HCl將噬菌體從磁珠上洗脫下來,室溫10分鐘。將試管放入磁架30秒,沉淀磁珠。移取含有洗脫的噬茼體上清,并用1m11inol/L Trls(pH 7.4) 中和。冰上保存洗脫液。
8.將0.75m1洗脫噬菌體加入到10ml對數生長的大腸桿菌TGl(A600約0.5) 中。4℃下儲存剩余的洗脫噬菌體。
9.37℃下靜置孵育洗脫物—大腸桿菌混合液,30分鐘。
10.將1ul和10ul感染的TGl細胞在100mmTYE/amp/glu平板上鋪板接種,滴定洗脫液(稀釋比例分別為104和103)。
11.離心剩余的細菌培養液,2700g 10分鐘。將沉淀重懸于250ul 2×TY中,并在2個150mmTYE/amp/R1u平板上鋪板,37℃孵育過夜。
12.次晨,每個平板加入3m1 2×TY/amp/glu,再用彎曲玻璃棒自平板上刮取細菌。將1.4ml菌液與0.6m1 50%的甘油(無菌過濾)混合制備甘油儲存料。-70℃下保存。分析產出滴定結果(步驟9)以確定哪個(從抗原農度=Kd/1、Kd/l0以及Kd/100)確定出相應的噬菌體以用于下一輪選擇的改良。過去,我們依據噬菌體EUSA測定的結合性克隆陽性率或依據BIAcore測定的活性噬菌體濃度,進行判斷。不過根據經驗,可以通過分析產出滴度作出選擇: 當產出滴度比抗原濃度下降更明顯時(即當比較來自Kd/l、Kd/10以及Kd/100的3個產出滴度時),一般是結合減少的結果,那么此濃度下的噬茵體不應用于后續的選擇。而應當用較高抗原濃度的噬菌體替代。我們每輪把抗原濃度平均降低大約90%倍,而在親和力成熟的zui后一輪常常使用飛摩爾的的抗原濃度。
13.從來自步驟ll的合適的甘油儲存料中制備噬菌體抗體;從本實驗方案步驟1重復進行。

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