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當前位置:首頁新聞中心用PCR識別不同的噬菌體抗體克隆

用PCR識別不同的噬菌體抗體克隆

更新時間:2013-03-05點擊次數:1691

[方法]
1.配制PCR“主混合液”,每克隆20ul PCR混合液, 包含:
● 水,15.5ul
● 10XRT緩沖液,2.0ul
● 5mmol/L dNTP, 1.0ul
● 5,引物,1.0ul
● 3,引物,1.0ul
● Taq聚合酶,0.2ul
如果PCR緩沖液中不含Mg2+,這應加至終濃度為1.5mmol/L。也可以使用與DNA聚合酶配套供應的PCR試劑。
2.取20fLl主混合液加到0.5m1管內,或加入96孔PCR微孔板孔內。
3.用l根牙簽輕輕接觸單個克隆并在PCR反應液中轉動,注意不要轉移太多材料。如在PCR反應液中有過量細菌,會抑制PCR反應。扔掉牙簽;或如有需要,用它在1個單獨的96孔培養孔板內培養基救援該克隆;或者在瓊脂平板上接觸表面。用1~2ul甘油儲存料或主板培養液,也可以代替相應克隆。
4.反應液上鋪上礦物油。
5.用PCR儀格內加熱試管或孔板至94℃,10分鐘。裂解細菌使其釋放模板DNA。然后,以94℃1分鐘、55~60℃1分鐘(對于Fab片段文庫的篩選則為2分鐘)、72℃ 1分鐘的條件孵育,共循環30次。
6.建議在PCR后取5ul PCR反應產物在2%瓊脂糖膠上檢測。這將顯示有多少克隆包含全長的插入序列。
7.PCR后,在礦物油下面加入20ul主混合液,成分如下:
● 乙酰化BSA(10mg/ml), 0.2ul
● BstNⅠ緩沖液(10×),4.0ul
● 水,15.3ul
● BstNⅠ (10U/ul),0.54ul
8.60℃孵育樣本2~3小時。
9.將2ul樣本染液與8ul反應混合物(取自礦物油下面)混合并在4%Nusieve瓊脂糖膠上電泳;此膠用含0.05ug/ml溴化乙錠的0.5倍TBE緩沖液配制。或者是用2.5%瓊脂糖膠電泳(此膠的分辨率較低)。
10.以100V(10V/cm)跑膠并在UV transillu minator上比較各種不同的單獨克隆的帶型。

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