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在微量滴定板中表達(dá)可溶性scFv

更新時(shí)間:2013-03-05點(diǎn)擊次數(shù):1430

[器材和試劑]
● 用于細(xì)菌培養(yǎng)的96孔圓底微量滴定板 (Nunc, 目錄號62162)
● 含100ug/ml氨芐青霉素和0.1%葡萄糖的2XTY培養(yǎng)基(2 ×TY/amp/
0.1%glu)
● 含100ug/ml氨芐青霉素和3mmol/L IPTG的2XTY培養(yǎng)基(2×TY/amp/glu/IPTG)(參見實(shí)驗(yàn)方案13.10)
● 噬菌體樣品

[方法]
1.用96孔無菌轉(zhuǎn)移設(shè)備或移液器從主板中,每孔取2ul;而后轉(zhuǎn)移至1個(gè)每孔含有100ul 2×TY/amp/0.1%glu的無菌96孔微量滴定板中。
2.將孔板在37℃振蕩孵育,直到A600值約為0.9(通常需2~3小時(shí))。
3.每孔加50ul 2XTY/amp/glu/IPTG(zui終IPTG濃度為lmmol/L)。繼續(xù)將孔板在30℃振蕩16小時(shí)。
4.以2700r/min離心孔板15分鐘;取上清可進(jìn)行ELISA.

純化scFv片段zui簡單的方式是:在其C末端添加六組氨酸標(biāo)簽,再用固相金屬離子親和層析(1MAC)進(jìn)行蛋白純化。大多數(shù)用于IMAC的試劑現(xiàn)在已加工為試劑盒銷售,并附有詳盡的說明。不過,應(yīng)當(dāng)注意的是,試劑盒中所提供的實(shí)驗(yàn)方案也許要根據(jù)不同的scFv載體構(gòu)建類型加以調(diào)整。例如,我們發(fā)現(xiàn):對在His標(biāo)簽前帶有myc標(biāo)簽的scFv洗滌時(shí),該咪唑濃度(20mmol/L)比攜帶了其他標(biāo)簽的scFv的咪唑洗滌濃度(5mmol/L)更高一些。
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